产品名称：肠道侵袭性大肠埃希氏菌EIEC核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
英文名称：Multiplex PCR Detection Kit for Diarrheogenic Escherichia coli(Fluorescent Probe Assays)

产品编号与包装规格：

产品简介：本试剂盒仅适用于食品中产志贺毒素（STEC）/肠道出血性（EHEC）、肠道致病性（EPEC）、肠道集聚性（EAEC）、肠道侵袭性（EIEC）、产肠毒素（ETEC）大肠埃希氏菌的毒力基因和类型判别的定性检测。

检测原理：基 于 Real Time PCR 技 术 ， 利 用 针 对《GB4789.6-2016》中的 12 个毒力基因设计的引物、荧光探针以及其他反应优化配置所需试剂组合成 A、B、C 三管体系，同时往三管体系加入待检样品即可进行扩增反应。在发生扩增过程中，荧光探针与目的基因片段结合，可被 Taq 酶分解并产生荧光信号，此时荧光定量PCR 仪可识别该荧光信号，同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线，进而判定大肠埃希氏菌的致泻类型。
A 管体系可用于 STEC/EHEC、EPEC 检测，B 管体系可用于 EAEC 检测和大肠埃希氏菌种属鉴定，C 管体系可用于 ETEC、EIEC 检测。

肠道侵袭性大肠埃希氏菌EIEC核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)产品组分：

储存条件与保质期：-20℃避光储存，有效期为 12 个月，避免反复冻融。冷冻条件下运输。

灵敏度：单通道最低检验限达到 100~500 cfu/Test。

所需其他材料和适用仪器：荧光定量 PCR 仪（具有能够检测 FAM、VIC、Cy5、ROX 标记的荧光通道）、高速离心机、移液器、移液枪头及离心管等。

肠道侵袭性大肠埃希氏菌EIEC核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)使用指南：

1，样品前处理：参照 GB 4789.6−2016，使用 1 μL 接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养 18 h~24 h 的待鉴定的可疑菌落，悬浮到含 30 μL 裂解液或者无菌水的 0.2 mL 无菌离心管中，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热 10 min；12000 r/min 离心 15 min，上清即为粗提的 DNA，可转移至 0.2 mL 无菌离心管中，在-20℃下可长期保存。也可以选择商业化的细菌基因组提取试剂盒进行提取；

2, 加样、反应

   1) 按照需求取 n 个 PCR 反应管（n=1 管阴性对照+待检测样品数+1 管阳性对照），从试剂盒中取出预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，以上每管加入 20 μL 预混液，待用。
   2) 向上述 n 个反应管中分别加入阴性对照、待测样品 DNA、阳性对照各 5 μL，总反应体积为 25 μL。盖紧管盖，短暂离心，立即进行 PCR 扩增反应。
   3) PCR 反应体系为 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 检测通道，在反应阶段 2 中 59℃时收集荧光信号，具体程序如下：

    注：在反应阶段 2 中 59℃时收集荧光信号，对于多通道荧光 PCR 仪，取荧光素“FAM”、“VIC”、“Cy5”、“ROX”为信号采集通道，淬灭基团选择“None”，染料校正选择“None”。

3, 结果：一般情况下，可通过软件自动设定的基线、阈值等直接读取检测结果。如需调整，可根据所使用仪器的自身情况（如噪声等）以及选取的不同荧光通道进行调整。

   1) 质量控制：阴性对照未出现明显的 S 型扩增曲线或Ct 值＞37，阳性对照出现 S 型扩增曲线且其 Ct 值＜25。若阴阳性对照不同时满足上述条件，则本次检测结果无效，应重新检测或与产品技术支持联系。

   2) 结果判读：（根据反应所得 Ct 值判读，具体见下表：）

各致病型阳性判别标准：

❖ astA 和 pic 基因可在细菌间转移，当与其他 DEC 毒力基因检测结果同时阳性时，则 astA 和 pic 基因不作为型别判定依据。
❖ stp 基因灵敏度稍低，为保证检测结果，检测样品的 DNA 浓度高一点为好。
❖ 一般猪源的 ST 基因和人源的 ST 基因在分离的菌株中只存在其中一种，特殊情况下除外。
❖ 多重 qPCR 检测可能出现不同荧光通道之间竞争抑制的问题，单基因分析时适当调整阈值线。