产品名称：大肠埃希氏菌O157:H7核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
英文名称：PCR Detection Kit for Escherichia coli O157:H7(Fluorescent Probe Assays)

产品编号与包装规格：

产品简介：本试剂盒适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7的检测。

检测原理：基于Real Time PCR技术，利用针对于大肠埃希氏菌O157:H7特异性基因的引物、荧光探针以及其他反应所需试剂，加入待检样品即可进行扩增反应。在发生扩增过程中，荧光探针与目的基因片段结合，可被Taq酶分解并产生荧光信号，此时荧光定量PCR仪可识别该荧光信号，同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线，进而判定大肠埃希氏菌O157:H7是否检出。

大肠埃希氏菌O157:H7核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)产品组分：

储存条件与保质期：-20℃避光储存，有效期为12个月，避免反复冻融。

灵敏度：最低检验限达到100 CFU/Test

所需其他材料和适用仪器：荧光定量PCR仪（具有能够检测FAM标记的荧光通道）、高速离心机、移液器、移液枪头及离心管等。

大肠埃希氏菌O157:H7核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)使用指南：

1，样品前处理

   1) 样品增菌液模板 DNA 的制备：
         a) 样品增菌：参照GB 4789.36-2016《食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》，取样品25 g（mL），加入到盛有225 mL改良EC肉汤（mEC+n）的无菌容器中均质，36±1℃培养18-24 h；
         b) 吸增菌液1 mL到1.5 mL规格的无菌离心管中，6000 r/min离心5 min，弃上清，用50 μL无菌超纯水悬浮洗涤沉淀1-2次，6000 r/min离心5 min，完全去除上清；
         c) 加入30 μL裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10 min；
         d) 12000 r/min离心15 min，上清即为粗提的DNA，可转移至0.2 mL无菌离心管中，在-20℃下可长期保存。

   2) 可疑菌落模板 DNA 的制备：挑取可疑菌落，充分悬浮于预先加有30 μL裂解液的无菌离心管中，后按照上述步骤c)、d)操作。

2, 加样、反应

   1) 按照需求取n个PCR反应管（n=1管阴性对照+待检测样品数+1管阳性对照），从试剂盒中取出预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，以上每管加入20 μL预混液，待用。
   2) 向上述n个反应管中分别加入阴性对照、待测样品DNA、阳性对照各5 μL，盖紧管盖，短暂离心，立即进行PCR扩增反应。
   3) PCR反应体系为25 μL，取FAM检测通道，在反应阶段2中60℃时收集荧光信号，具体程序如下：

   注：在反应阶段2中60℃时收集荧光信号，对于多通道荧光PCR仪，取荧光素“FAM”为信号采集通道，淬灭基团选择“None”，染料校正选择“None”。

3, 结果：一般情况下，可通过软件自动设定的基线、阈值等直接读取检测结果。如需调整，可根据所使用仪器的自身情况（如噪声等）以及选取的不同荧光通道进行调整。

   1) 质量控制：阴性对照未出现明显的S型扩增曲线或Ct值＞35，阳性对照出现S型扩增曲线且其Ct值＜30。若阴阳性对照不同时满足上述条件，则本次检测结果无效，应重新检测或与产品技术支持联系。

   2) 结果判读：（根据反应所得Ct值判读，具体见下表：）