一步法预加染料RT-PCR试剂盒PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)
| 产品编号 | 原厂编号 | 纯度 | 等级 | 规格 | 产品描述+危险性 | 货期 | 包装单位 | 市场价 | 会员价 | 购买 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 100853 | RR057A | -- | -- | 50T/盒 | -- | 3-5个工作日 | 盒 | ¥1400.00 | 会员登录 |
■ 制品内容 (50 次量)
| PrimeScript 1 Step Enzyme Mix | 100 μl |
| 2X 1 Step Buffer (Dye Plus) | 625 μl × 2 |
| Control F-1 Primer (20 μM)*1 | 20 μl |
| Control R-1 Primer (20 μM)*2 | 20 μl |
| Positive Control RNA (2×105 Copies/μl) | 20 μl |
| RNase Free dH2O | 625 μl × 2 |
| *1 Positive Control RNA用上游引物。 | |
| *2 Positive Control RNA用下游引物。 | |
■ 制品说明
| PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，RT-PCR方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 本试剂盒采用了一步（One Step）RT-PCR法。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂，避免污染危害。同时反应液中已含有电泳时所必需的色素试剂（蓝色和黄色色素），反应后可以直接进行电泳。反应液为鲜艳的绿色（Emerald Green），电泳时指示效果明显，容易观察样品的电泳位置。反转录反应使用了具有很强延伸能力的反转录酶PrimeScript RTase。该反转录酶对具有复杂二级结构的RNA模板也具有很强的延伸能力；PCR反应使用了扩增性能优越的Hot Start型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，大大提高了本试剂盒的扩增性能和反应特异性。反应试剂已优化，以实现与不含染料和loading buffer的传统RT-PCR系统具有相同反应效果。在本试剂盒中，已将PrimeScript RTase、TaKaRa Ex Taq HS、RNase Inhibitor以及One Step RT-PCR用稳定剂等配制成了Premix型的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix；同时把反应用Buffer、dNTP以及One Step Enhancer Solution配制成了Premix型的2×1 Step Buffer（Dye Plus）的形式，使实验操作时的反应液配制和电泳检测更为简单方便。 本试剂盒具有以下特点： 1. 进行高效的RT-PCR扩增。 2. 反应液制备简单，可直接进行凝胶电泳。 3. 反转录温度可以设定为50℃，能够有效抑制非特异性扩增。 4. 可减少由于错配和引物二聚体造成的非特异性反应。 |
| 本试剂盒中含有进行One Step RT-PCR反应用的全部试剂，可以方便有效地对RNA进行扩增分析。 |
■ 各种引物的序列
| 引物名称 | 各引物序列 |
| Control F-1 Primer | 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ |
| Control R-1 Primer | 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ |
■ Positive Control RNA
本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。
图1. Positive Control RNA：使用Control Primer可以扩增462 bp的DNA片段
■ 原理
PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）可在同一反应管中连续进行由PrimeScript RTase将RNA反转录为cDNA，再由TaKaRa Ex Taq HS扩增此cDNA的RT-PCR反应。
图2. PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus) 原理图
■ 保存
-20℃。
■ 试剂盒特点
| RNA模板 | 适用于所有RNA |
| 扩增片段大小 | ～8 kb |
| PrimeScript 1 Step Enzyme Mix | PrimeScript RTase |
| DNA Polymerase (TaKaRa Ex Taq HS) | |
| RNase Inhibitor | |
| 2 × 1 Step Buffer (Dye Plus) |
含有反应Buffer dNTP Mixture (终浓度400 μM) One Step Enhancer Solution 色素、比重剂 |
| 1st strand cDNA合成用引物 | 特异性下游PCR Primer (Oligo-dT Primer和 Random引物不能使用) |
| 操 作 | 在同一反应管中连续进行RT-PCR反应 |
■ 使用注意
1. 当同时需要进行数次RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 使用PrimeScript 1 Step Enzyme Mix时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3. 2 X 1 Step Buffer (Dye Plus) 使用前用Vortex充分混匀，离心后使用。
4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。
5. 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。
6. 分装试剂时务必使用新的枪头，以防止样品间污染。
7. 使用本试剂盒进行反转录反应时必须使用特异性的反转录引物，Random Primer、Oligo dT Primer不能使用。
