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完整的PCR扩增实验过程及实验器材

发布日期:2014-08-20 10:55:59 【关闭】
摘要:

完整的PCR扩增实验过程及实验器材

【实验目的】

通过本实验学习 PCR 反应的基本原理,掌握 PCR 的基本操作技术。

【实验原理】

PCR 用于扩增位于两端已知序列之间的 DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向

DNA合成。

基本原理及过程如下:

PCR 循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定 DNA

聚合酶进行 DNA合成。

1. 变性:加热使模板 DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单

链,即变性阶段。

2. 退火:在体系温度降至 37-65℃,模板 DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物

与模板链 3’端结合,形成部分双链 DNA,即退火阶段。

3. 延伸:体系反应温度升至中温 72℃,耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,在引物

的引导下,利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按 5’到 3’方向复制出互补 DNA,即引物的延伸阶段。

上述 3 步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。从理论上讲,每经过

一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过 25~30 个循环后DNA可扩增 106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成

的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

【仪器、材料、试剂】

(一) 仪器材料

1.PCR 热循环仪

2.电泳凝胶成像系统

3.高速离心机

4.Tip 头离心管

(二) 试剂

1.DNA模板(自己提取 DNA)

2.4种 dNTP

3. 引物 1、引物 2

4. Taq 酶

5. 琼脂糖

6. DNA相对分子量标准物

7. 三蒸水

【实验步骤】

(一)PCR反应混合液的配制:反应体系 25 μL, 在无菌的0.2 mL 离心管中按下列操作程序加样:

1.按下列次序加入下列各组成分:【这一步用的仪器及材料有移液器(含吸头)、EP管】

反应物 体积/μL

ddH2O 17.3

10 x Buffer 2.5                 

25 mmol/L MgCl2 2.0 

10 mmol/L dNTP 0.5 

10 μM 上游引物 1 0.4 μmol/L

10 μM 下游引物 1 0.4 μmol/L

DNA Taq 聚合酶 0.2   2. 用手指轻弹管底,使溶液混匀

3. 高速离心机瞬时离心,使溶液集中于管底【离心机】

(二) PCR 循环程序【PCR仪】

按下述程序进行扩增:

 94℃ 预变性 3min

 94℃ 变性 30s

 50℃ 退火 40s   40cycle

 72℃ 延伸 1min

72℃ 充分延伸 5min

(三)PCR扩增结果的检测

1.配制 1.0% 琼脂糖凝胶 【高压蒸汽灭菌器电子天平、制胶板、插样梳、锥形瓶、微波炉或电炉】                                                   

2.4μl PCR产物上样 【移液器】                           

3.5-8V/cm的电压电泳【电泳槽电泳仪

4.电泳结束后,EB 染色20min 【移液器】

5.凝胶成像系统观察拍照分析结果【凝胶成像系统

【注意事项】

1. 隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头。

2. 加样完成后要瞬时离心,保证样品沉于管底。

3. 加样顺序合理化,避免交叉污染。

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