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蛋白质的分离、鉴定

发布日期:2014-08-20 08:50:02 【关闭】
摘要:

蛋白质分离纯化与鉴定

一 与蛋白质分离纯化相关的理化特性:

能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因是不同蛋白质在许多理化性质上有着极大的不同。这些理化性质的不同是由于氨基酸的数目和序列不同造成的。与蛋白质分离纯化相关的理化特性,分子大小、分子形状、带电特性、溶解特性、与配体特异性结合不同、吸附性质、变性和复性。

分子大小常用方法:透析、超滤、凝胶过滤、离心

分子形状:梯度离心和电泳

电荷:电泳,离子交换层析

沉淀法:盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法

配体特异性结合:免疫亲和层析、生物亲和层析、金属螯合亲和层析、拟生物亲和层析

吸附性质:羟基磷灰石层析、疏水层析

变性和复性:蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。方法:尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白。

二 分离方法

沉淀法

离心法

电泳法

超滤法

相分配法

层析法

三 蛋白质分离纯化步骤

1 选择实验材料及预处理:选择实验材料,物种的选择、组织的选择

实验材料预处理:液体材料——过滤、离心

固体材料——洗涤:自来水—蒸馏水—提取缓冲液、材料破碎

材料破碎方法:机械剪碎、研磨、反复冻融法、超声破碎法、高压匀浆法酶解法。

2 蛋白质的提取

2.1提取分离原则

尽可能多地提取目的蛋白,同时避免因热、 pH或有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素造成活性丢失。选择合适的pH、选择合适的离子强度,选择合适的比例。

2.2 提取液的确定

2.3 温度 0-4℃

3 蛋白质的粗分级

使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后,蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低,采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩,同时去除大量的杂质,这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。

硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。

4 蛋白质的细分级

常用实验技术,层析和电泳

4.1 层析包括  分子筛层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析。

实验装置:蠕动泵、层析柱、检测器、记录仪、部分收集器。

4.2 电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS--PAGE)、等电聚焦电泳( Isoelectric focusing- IEF)、双向电泳。

四 蛋白质鉴定

1 测定蛋白质的浓度

凯氏定氮法:蛋白质平均含氮量为16﹪,首先测定氮的含量,进而估算蛋白质的含量。

紫外吸收法:芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收,核酸在260nm附近有最大光吸收.

分光光度法:蛋白质样品与特定的显色剂反应,反应产物在特定的波长的光吸收与蛋白质含量成正比,利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量,蛋白质含量测定,考马斯亮兰法等

2测定蛋白质的纯度:

色谱纯:在层析图谱中只有一个洗脱峰

电泳纯:在电泳图谱中只有一条电泳条带

结晶纯:能够获得蛋白质晶体

3鉴定目标蛋白质

蛋白质分子质量与等电点的测定

氨基酸组成及顺序分析

蛋白质结晶与结构分析

蛋白质活性及功能测定

分子质量及等电点测定:分子质量-SDS-PAGE、PAGE 等电点:等电聚焦(IEF)

氨基酸组成及顺序分析:水解蛋白质为氨基酸,方法—全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定

结晶及结构分析:1三维结构-X射线晶体衍射法—蛋白质晶体

2核磁共振—溶液中蛋白质的三维结构3电子显微镜

免疫印迹(western-blotting)鉴定:免疫印迹包括三个步骤

1凝胶电泳2转膜抗原3抗体显色反应

 五 实验设备

(1)超声波细胞破碎机 适用于5-100g湿菌体超声破碎,实验室规模用。一般可选择直径10、15、20mm的超声探头。推荐国产机器为宁波新芝。

(2) 高压匀浆机 大规模生产用,对菌体量无限制。破菌效果好,但要注意冷却。 

(3)高分散乳化机 均匀悬浮菌体用,比搅拌快,均匀性好,特别适合于大规模生产。另外,大规模生产时缓冲液的配制很有用,可快速溶解、混匀。推荐品牌:IKA 国产品牌:FLUKO; 

(4)中空纤维超滤柱 大规模生产时做菌体收集用,要配合大蠕动泵及压力表。 (5)高速冷冻离心机 小试、中试菌体收集用,破菌后离心,包涵体溶解后离心、小规模离心超滤等。推荐品牌:BECKMAN、日立、Eppendorf 

(6)磁力搅拌器 缓冲液配制,包涵体溶解等。推荐品牌:国产的都行,最好配4或6工位的。 

(7)真空泵 离心上清过滤、缓冲液过滤、样品过滤等。推荐品牌:Millipore WP61型。 

(8)过滤器 同真空泵配合使用。推荐品牌:Sartorius烧结金属垫板的不锈钢50mm滤器。

(9) pH计 缓冲液配制、样品pH调节用。推荐品牌:梅特勒 

(10)电导仪 测定缓冲液及样品的电导率。 

(11)纯水仪 推荐品牌:优普、和泰、博科

(12)紫外可见分光光度计 测定蛋白浓度

(13)核酸蛋白检测仪 纯化时在线监测。如果不是用AKTA、Bio-Rad之类的高级仪器,就必须要了。 

(14)蠕动泵 简单纯化系统用、包涵体稀释复性。推荐品牌:兰格。 

(15)纯化系统 推荐品牌:AKTA explorer、AKTA Purifier。

(16)膜超滤器 蛋白样品浓缩、缓冲液置换、以及药品级蛋白纯化时缓冲液的去内毒素用。推荐品牌:Millipore Labscale、Pellicon(泵可用国产的兰格) (17)蛋白电泳仪 SDS-PAGE、Westblot用。推荐品牌:Bio-Rad。

(18) 脱色摇床 电泳染色、脱色用。 

(19) 制冰机 破菌时冷却用。 

(20) 恒温培养箱 融合蛋白酶切去除tag时恒温用,做ELISA时用。

(21) 凝胶成像仪  

(22) 电磁炉 加热电泳样品。 

(23) 微波炉 电泳考染脱色。加热水,溶解尿素、硫酸铵等。

(24) 微量取样器  

(25) 超净工作台 做蛋白样品的无菌过滤用。

(26) 冰箱  

(27) 电风扇 小量样品的浓缩风干。 

(28) 电子天平 

(29) 空调 蛋白纯化对环境的要求。 

(30) 超声波清洗机 缓冲液脱气用,当然也可以采用真空泵抽真空的方法。特别是做疏水层析时,有机溶剂与水相混溶时脱气。 

(31) 酶标仪、洗板机 测定蛋白质免疫活性用。特别当我们纯化的蛋白原料含量很低时,SDS-PAGE无法有效监测就必须应用Elisa方法。 

(32) 恒温干燥箱、干烤箱 恒温干燥箱用于玻璃器皿、一般塑料件洗涤后的干燥,设定温度40-60度。 干烤箱用于干烤灭菌,内毒素去除等,设定温度180-220度。 

(33) 酸缸 药品级的蛋白纯化要求容器都要用酸缸泡过。 

(34) UPS电源 保护层析设备,防止数据丢失。 

(35) 层析冷柜 低温冷室 对温度敏感的蛋白纯化需要。 冷室作用同上

(36) 冷冻干燥机(器)、 蛋白质保存较佳的方案。从手提式到药厂的大规模冻干室形式多样。

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