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双向电泳操作步骤

发布日期:2014-08-19 17:19:11 【关闭】
摘要:

         双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

 

【实验方法】

 

水化上样( 被动上样)

 

1. 从冰箱中取出 IPG 胶条,室温放置 10min。

2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品,槽两端各 1cm 左右不加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡,否则会影响胶条中蛋白质的分布。

3. 用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的保护层。注意:碱性端较脆弱,应小心操作。

4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意:不要将样品溶液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收; 还使胶条下面的溶液产生气泡。如产 生了气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶走。

5. 放置 30~45min 大部分样品被胶条吸收,沿着胶条缓慢加入矿物油,每根胶条 约 3ml(17cmIPG),防止胶条水化过程中液体蒸发。

6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化 11~15h。

 

第一向 等电聚焦

 

1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上,加 ddH2O 5~8μl 润湿。

2. 取出水化好的胶条,提起一端将矿物油沥干,胶面朝下,将其置于刚好润湿 的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

3. 将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中,胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正 极,确保胶条与电极紧密接触。

4. 在每根胶条上覆盖 2- 3ml 矿物油。

5. 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。

6. 聚焦结束的胶条,立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样 品水化盘中,- 20℃冰箱保存,电泳前取出胶条, 室温放置10 分钟,使其溶解。

 

第二向 SDS-PAGE电泳

 

1. 配制 12%的丙烯酰胺凝胶。

2. 待凝胶凝固后, 倒去分离胶表面的MilliQ水、 乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ 水冲洗。

3. 配制胶条平衡缓冲液 I

4. 在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用 MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品,这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

5. 将胶条转移至样品水化盘中,加入 6ml(17cmIPG)平衡缓冲液 I ,在水平摇床 上缓慢摇晃 15 分钟。

6. 配制胶条平衡缓冲液 II 。

7. 第一次平衡结束后,取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体,放入平衡缓 冲液 II 中,继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

8. 用滤纸吸去 SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体,将二向凝胶放在桌面上, 凝胶的顶部面对自己。

9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。

10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。

11. 第二次平衡结束后,取出胶条,用滤纸吸去多余的平衡液(将胶条竖在滤纸 上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面) 。

12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电泳缓冲液中漂洗数次。

13. 将胶条背面朝向玻璃板,轻轻放在长玻板上,加入低熔点琼脂糖封胶液。

14. 用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接 触。注意:不要在胶条下方产生气泡, 应推动凝胶背面的支撑膜, 不要碰到面胶。

15. 放置 5 分钟,使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

16. 打开二向电泳制冷仪,调温度为 15℃。

17. 将凝胶转移至电泳槽中,加入电泳缓冲液,接通电源,起始时用的低电流(5mA~10mA/gel/17cm) ,待样品在完全走出IPG 胶条,浓缩成一条线后,再加大电流 (20-30mA/gel/17cm) 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

18. 电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防 止污染胶面) 。

19. 进行染色。
 

【实验材料】

 

       细胞样品

 

【试剂、试剂盒】

 

      ddH2O          溴酚蓝指示剂              矿物油            丙烯酰胺

      乙醇           MilliQ 水饱和正丁醇        SDS               琼脂糖

 

【仪器、耗材】

 

       样品水化盘               冰箱               厚滤纸                 摇床

        电泳槽                   电泳仪             镊子                二向电泳制冷仪

        手套

 

【实验步骤】

 

       1. 样品制备;2. 第一向等电聚焦;3. 第二向SDS电泳;4. 凝胶的染色;5. 凝胶扫描和分析
 

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