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蛋白定量Commassie法和BCA法

发布日期:2014-08-19 16:58:31 【关闭】
摘要:

蛋白定量Commassie法和BCA法

蛋白测定是在生命科学研究中最广泛应用的方法之一。

 
在蛋白提纯,电泳,免疫分析,细胞生物,分子生物和其他研究应用时评估蛋白浓度是必需的。
虽然目前有各种不同的蛋白测定方法,但仍然还没有一种测定方法被认为是广泛适合于所有的应
用要求。每种方法都有它的优点和限制。一般来说,研究中经常需要用到一种以上的蛋白测定方
法以排除一些未知的物质的干扰。

 

大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中,化学试剂加入到蛋白样品溶液里
产生颜色变化,这一变化可由分光光度计或酶标仪检测,并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。
博士德为大家提供两种蛋白测定手段,每种都有其独特的优点。如果样品数量较多,可以同时使
用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素:缓冲液的化学
组成和检测的蛋白量。

 

Commassie法(Bradford法):

原理:在酸性条件,蛋白质与考马斯染料G-250结合,颜色从棕色变为蓝色,在595nm处检测吸
光值然后与标准曲线对比,即可计算出待测蛋白的浓度。

 

BCA法:

原理:在碱性条件下,蛋白将Cu++还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色络合物,测定其在562nm
处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。

 

现对这两种方法进行比较:

 

一、实验材料:

细胞总蛋白提取试剂盒(AR0103)

M231

BCA蛋白定量试剂盒(AR0146)

Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒(AR0145)

 

二、操作步骤:

Commassie法:

1.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml,1000 ug/ml,500 ug/ml,
250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

4.滴加200ul考马斯增强型试剂(溶液A)至每孔混匀并充分震荡30S

5.停止震荡,在室温孵育样品10min

6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。

7.绘制标准曲线,再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

 

BCA法:

1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液,充分混匀。

2.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml,1000 ug/ml,500 ug/ml,
250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

3.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

4.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

5.滴加200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S

6.停止震荡,在37度孵育样品30min

7.在酶标仪中测量562nm时的吸光值。

8.绘制标准曲线,再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

 

三、实验结果:

  1 2 3 4 5 6 7
Commsie法吸光值 0.530 0.522 0.431
 
0.262 0.118 0.041
 
0.001
 
BCA法吸光值 0.812 0.444 0.257
 
0.140
 
0.06 0.037
    
 
0.017
 
 
其中1到8为2000ug/ml,1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的标准浓度的BSA蛋白,9为空白孔,
样品1为8倍稀释M231总蛋白,样品2为32倍稀释M231总蛋白

 

Commassie法: 

 

为了测试准确,应在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。
由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/ml

 

Commassie法优点是:

1.灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料
结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓
度的变化比Lowry法要大的多。

2.测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白
质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之
间,颜色的稳定性最好。

3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇
、EDTA等均不干扰此测定法。

 

此法的缺点是:

1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时
有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠
(SDS)和0.1M的NaOH。(如同0.1M的酸干扰Lowary法一样)。

3. 标准曲线也有轻微的非线性,在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。因而不能用Beer定律进行
计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

 

BCA法: 
 


由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml

 

BCA法特点:   

1. 灵敏度高,检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg,待测样品体积为1-20μl 。

2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20,60,80。   

3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。   

4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。  5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM

 

 

BCA法和Commassie法各有优势,在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用,以消除定量的误差。

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